Bij de verhuising naar Florence waren menselijke gevoelens aan het werk, die wij nu moeilijk nog kunen verklaren, hij heeft immers na zijn vertrek naar Florence de moeder van zijn kinderen teruggezien. De beide meisjes, Virginia en Livia, werden op zeer jeugdige leeftijd, respectievelijk 14 en 13 jaar, in het klooster van San Matteo te Arcetri geplaatst. Waarschijnlijk heeft hij dit gedaan om te ontkomen aan de financiële problemen die de bruidschat van een dochter met zich meedroeg te dragen, hij moest ook nog de gezinnen van zijn broers kunnen onderhouden! Bovendien was het onduidelijk als zij, kinderen uit een onwettig huwelijk, ooit een man zouden kunnen krijgen. Galilei heeft echter altijd met zijn oudste dochter contact gehouden. In de jaren van zijn zwaarste beproevingen was zij zijn grootste steun, maar zij overleed jong in 1634. Misschien heeft Galilei's moeder, heerszuchtig en ongemakkelijk, hierbij een hoofdrol gespeeld.
Eerste mathematicus en filosoof bij de groothertog van Toscane, was vanaf nu Galilei's titel. Men verwachtte van hem hoogleraar aan de universiteit van Pisa te zijn en, echter zonder verplichtingen, colleges te geven. De vaste en duidelijke plichten van het werk aan een openbaar instituut werden nu vervangen door, de veel minder vastgelegde, in wezen moeilijker te vervullen plichten, aan het hof, waar voortdurend het gevaar bestond betrokken te worden in de naijver tussen verschillende groepen gunstelingen. In bepaalde opzichten was Galilei's vrijdheid te Florence beperkter dan die hij had gehad te Padua. Zo moest hij voor reizen een speciale toestemming hebben. De eerste reis, evenals de volgende naar Rome, viel in maart of juni 1611 en stond geheel in het teken van zijn astronomische ontdekkingen gedaan met zijn telescoop. Hij werd als ontdekker geëerd, ook door het befaamde Collegio Romano, het geleerde Jezuïtencollege, dat toonaangevende wiskundigen onder zijn meden mocht tellen en hij ontving het lidmaatschap van de Accademia Linceo. De 'Accademie' was ontstaan op persoonlijk initiatief van koning Federico Cesi in 1603. Galilei werd het zesde lid. Ze verenigde een ,aanvankelijk zeer kleine, groep van geleerden van de meest uiteenlopende aard. Deze hadden geen gemeenschappelijk aanvaarde werkwijze, maar waren voornamelijk verbonden in hun afkeer voor het verstarde en eenzijdige onderwijs in de universiteiten en in hun voorkeur voor de directe studie van en in de natuur. De accademie had geen vast programma; ze weerde uiterlijke dwang, maar verbond haar leden door haar morele standaard. Bovendien verzorgde zij de uitgave van de werken van haar leden. Galilei was bijzonder verheugd met de onderscheiding, met dit lidmaatschap aan hem verleend, voortaan vermeldde hij dit onderaan zijn werken. De groep had voor Galilei een grote betekenis. Cesi overleed in augustus 1630 zodat juist in deze benarde periode zijn steun ontbrak. Tijdens deze periode gaat ook Galilei's overtuiging dat het Copernicaanse stelsel het juiste is een belangrijke rol spelen. Reeds in 1597 had hij aan Kepler geschreven al jarenlang een overtuigd Copernicaan te zijn, maar het onverstandig te achten veel ruchtbaarheid aan deze opvatting te geven. Waarschijnlijk meende hij, dat de objectieve, overtuigende bewijzen voor de juistheid van dit stelsel nog ontbraken. Maar zijn astronomische ontdekkingen met de telescoop toonden hem de onhoudbaarheid van het oude en de juistheid van het Copernicaanse stelsel aan. Dat het maanoppervlak van zichzelf donker was en vele oneffenheden vertoonde, bewees de onjuistheid van de Aristotelische these der volmaakte hemellichamen, van geheel ander wezen dan de aarde. De satellieten van Jupiter toonden aan hoe deze planeet er een eigen roterend stelsel van manen op na hield, waarvan het middelpunt in de planet zelf gezocht moest worden en niet in de aarde. In de Sidereus Nuncius kondigt Galilei aan dat hij het 'systeem der wereld' zal schrijven, waarin de stelling, dat de zon het rustend middelpunt van het heelal is en de aarde zich daaromheen beweegt als een 'dansende ster', uitvoerig bewezen zal worden. Een tweetal nieuwe ontdekkingen bevestigden hem deze stelling: die van de schijngestalten van Venus en van de zonnenvlekken, zelf tot het oppervlak van de zon behorend en de rotatie van de zon verradend, daar ze zelf allen de beweging van zuidwest naar noordoost over de zon uitvoeren. De (3) Brieven over de zonnevlekken, die hij in het Italiaans schreef aan Mark Welser, burgemeester van Augsburg, vormden een gelegenheidsgeschrift. Welser had hem enkele brieven over zonnevlekken toegezonden van een landgenoot, de jezuït Scheiner. Deze verklaarde ze uit groepjes, langs de zon trekkende kleine planeten. Op die wijze werd de theorie van de smetteloze zon gered. In zijn brieven sprak Galilei zich openlijk en ongedwongen uit over zijn voorkeur voor het Copernicaanse stelsel. Maar in datzelfde jaar werd de tegenstand tegen zijn opvatting heviger. Ze paste precies in het patroon van zijn nieuwe maatschappelijk situatie: verdachtmaking vanaf de kansel, uitlokken van compromitterende uitspraken en bestrijding door de aanhangers van Aristoteles. De aanleiding was onschuldig. Na een maaltijd aan het hof werd de Copernicaanse leer in een kleine groep vurig verdedigd door Galilei's leerling Benedetto Castelli. Sommigen achten haar onverenigbaar met bepaalde duidelijke, voor geen misverstand vatbare uitspraken van het Heilige Schrift. Op verzoek van Castelli zette Galilei, die bij deze discussie niet aanwezig was geweest, zijn mening uiteen in een brief, die zoals gebruikelijk in afschriften rondging en door Galilei's vijanden ook ter ogen van Inquisitie te Rome werd gebracht. Uitvoeriger en rijker gedocumenteerd kwam Galilei daarom nog eens op de kwestie terug in een brief aan groothertogin Chistina, de moeder van de toen regerende vorst. Hij betoogde dat er onmogelijk tegenstrijdigheid tussen bijbelse uitspraken en gefundeerde wetenschappelijke inzichten kon optreden, omdat beide uitdrukking gaven aan de waarheid, die één en ondeelbaar is. De situatie ontwikkelde zich echter ongunstig, Galilei achtte het noodzakelijk om zelf orde op zaken te gaan stellen. Zo begaf hij zich in het najaar van 1615 opnieuw naar Rome, met een tweeledig doel voor ogen: Hij wilde de Kerkelijke autoriteiten van zijn eigen integriteit en rechtzinnigheid overtuigen (1) en de kerk weerhouden van een afwijzen van de Copernicaanse leer (2), want hij zag onmiddellijk in hoe zo'n situatie alleen maar schadelijk kon zijn. Hoewel hij zich gedurende deze maanden tot het uiterste weerde, en al zijn invloed bij de kerkelijke leiders aanwende, slaagde hij hierin niet. Wel wist hij zich persoonlijk te rechtvaardigen, maar een afwijzing van de Copernicaanse leer kon hij niet voorkomen. Het Heilig Officium legde aan zijn, daartoe aangestelde, theologen in februarie 1616 ter beoordeling beide volgende stellingen voor:
1. de zon is het centrum van de wereld en daarom niet bewogen door enige lokale beweging;
2. de aarde is niet het centrum van de wereld noch onbeweeglijk, maar beweegt als geheel en ook met een dagelijkse beweging.
De stellingen bedoelden de Copernicaanse leer samen te vatten. Reeds na enkele dagen kwam het oordeel: unaniem werd de eerste stelling dwaas en absurd genoemd, filosofisch en formeel ketters, waar zij uitdrukkelijk de leer van het Heilig Schrift in vele passages weerspreekt, zowel in haar letterlijke betekenis als naar de gangbare uitleg van de HH vaders en doctoren in de theologie. De tweede stelling werd eenstemmig geoordeeld hetzelfde wijsgerige verdict te verdienen als de eerste, en, wat de theologische waarheid betreft, ten minste dwalend in het geloof te zijn. Aan Galilei werd de verplichting opgelegd van zijn Copernicaanse mening afstand te doen en deze leer niet meer te verdedigen.
Men wijst er nogal eens op, dat deze beslissing geen dogmatisch gezag had. Daarvoor zou ze door een Concilie of door de paus ex cathedra moeten worden uitgesproken en dat is nimmer geschied. Ook Descartes zinspeelt daarop als hij in 1633 van Galilei's veroordeling hoort:
Ik weet wel dat men zou kunnen zeggen dat alles wat de inquisitoren te Rome beslist hebben, daarmede niet dadelijk tot een geloofsartikel wordt en dat het daartoe eerst noodzakelijk door het Concilie zou moeten worden bekrachtigd.
In het zich van de machtsverhoudingen in Italië is dat maar een povere uitvlucht. Verzet tegen deze uitspraak kon met een inquisitie-proces zonder hoger beroep en de terdoodveroordeling eindigen. Bovendien had de uitspraak een groot moreel gezag: ze werd dadelijk wereldkundig gemaakt en alle plaatselijke inquisitoren bindend opgelegd. Er viel op geen wijze meer aan te ontkomen.